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Práctica 2 - Determinación del grado de calentamiento de la leche

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DETERMINACIÓN DEL GRADO DE CALENTAMIENTO DE LA LECHE

Este segundo módulo de prácticas de laboratorio está destinado a completar la inspección y control de la calidad de la leche. Tienen como finalidad determinar el grado de calentamiento de la leche mediante técnicas de laboratorio, por lo que se aplica a leches higienizadas y leches tratadas térmicamente.

El alumno tendrá que evaluar las muestras de leche que les proporcione el profesor de prácticas y aplicar las técnicas que se describen a continuación, para conocer el tratamiento térmico aplicado a cada muestra problema. La determinación del grado de calentamiento tiene un doble interés ya que permite:

  • Determinar la efectividad de los tratamientos térmicos utilizados en las industrias de transformación de la leche y obtención de productos lácteos para poder asegurar la calidad sanitaria y vida comercial de los mismos.

  • Evitar los fraudes al sustituir una leche cruda por una higienizada

 

OBJETIVOS

  • Conocer la metodología de laboratorio que se pueden aplicar para determinar el grado de calentamiento de la leche.

  • Diferenciar entre leche pasterizada y esterilizada de acuerdo a la inactivación de las enzimas presentes en la misma.

 

PRUEBA DE LA FOSFATASA ALCALINA (Prueba de Aschaffenburg y Muellen)

Fundamento

La fosfatasa alcalina es una enzima presente en la leche cruda y progresivamente inactivada por calentamiento a temperaturas superiores a 60°C. Las temperaturas normales de pasterización baja y alta de la leche la inactivan. Por ello debe estar ausente en una leche correctamente pasterizada. La ausencia de esta enzima termolábil a la salida de la leche del pasterizador permite asegurar que la pasterización ha sido efectuada a una temperatura suficientemente alta para asegurar la destrucción de los gérmenes patógenos, normalmente destruidos por la pasterización. Sin embargo, hay que tener en cuenta que esta enzima se inactiva con la pasterización baja (tratamiento LTLT, low temperatura long time) y no con el tratamiento de pasterización alta (HTST, high temperatura short time, min 71.7ºC durante 15 seg) que se debe aplicar a la leche pasterizada destinada a consumo humano.

La actividad de la fosfatasa alcalina se determina por la acción hidrolítica de dicho enzima sobre un substrato sintético que da una coloración a la muestra de leche. Se utiliza un kit colorimétrico cualitativo que nos pone en evidencia la presencia de la enzima.

Material

  • Tubos de ensayo de 10 mL, gradilla y tapones.

  • Pipetas de graduadas.

  • Baño maría a 37°C.

 

Reactivos

  • Kit de determinación de Fosfatasa alcalina en leche LACTOGNOST

Procedimiento

  • Hervir 5 mL de leche cruda para preparar un control.

  • Poner en dos tubos de ensayo P (muestra problema) y C (control) 10 ml de agua destilada y adicionar a cada uno de ello una tableta de Lactognost I y II. Antes de adicionar las tabletas es conveniente machacarlas en un mortero ya que es difícil disolverlas en el agua. Tras adicionar las tabletas remover con una varilla de vidrio para facilitar la disolución.

  • Pipetear 1 ml de leche en cada uno de los tubos según corresponda el tipo de muestra e introducir en el baño o estufa a 37ºC durante 1 hora.

  • Posteriormente añadir a cada tubo una cucharadita del reactivo Lactognost III y homogeneizar.

  • Leer el color a los 10 minutos. La existencia de color azul indicará presencia de actividad de la fosfatasa alcalina.

Observaciones e Interpretación

La ausencia de fosfatasa indica claramente una correcta pasterización baja. La presencia de fosfatasa en una leche que se presupone pasterizada indica que la leche no ha sido sometida a un tratamiento correcto de pasterización baja, ó que la leche ó los productos lácteos se hayan contaminado posteriormente con una partida de leche no pasterizada.

 

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA (Prueba de Storchs)

Fundamento

La actividad de la enzima peroxidasa en la leche se utiliza para el control de la pasteurización. La enzima peroxidasa se mantiene activa tras el proceso de pasteurización baja (LTLT) de la leche, poniéndose en evidencia su actividad por la aparición de un color azul tras la reacción. Sin embargo, cuando el método de pasteurización aplicado a la leche es de mayor temperatura (pasteurización alta, HTST) se destruye la enzima, no apareciendo color en los 30 segundos siguientes al desarrollo de la reacción.

El método es cualitativo y se basa en poner en evidencia la presencia de la enzima mediante el desarrollo de una reacción colorimétrica. La enzima peroxidasa presente en la leche descompone el peróxido de hidrógeno. El oxígeno atómico liberado oxida la 1,4 difenildiamina, incolora, que se convierte en indofenol púrpura, dando una coloración azulada que es proporcional a la concentración de la enzima en la leche.

 

Materiales

  • Tubos de ensayo.

  • Pipetas de 5 y 2 mL.

 

Reactivos

  • Solución de 1,4 fenilendiamina: disolver 2 g de fenilendiamina (C6H8N2) en agua caliente a 50°C y diluir hasta 100 mL Conservar la solución en un frasco de color marrón oscuro con tapón de vidrio y almacenar en un lugar fresco y al abrigo de la luz. Unos o dos días después de la preparación, la solución de 1,4 difenilenamina forma sedimento, por lo que es necesario desecharla.

  • Solución de peróxido de hidrógeno: diluir 9 mL de peróxido de hidrógeno al 30% en agua hasta 100 mL Añadir 1 mL de ácido sulfúrico concentrado por litro de solución, como estabilizador. Esta solución permanece estable durante un mes si se conserva en un lugar fresco y al abrigo de la luz, en un frasco con tapón de vidrio que impida el contacto con compuestos orgánicos.

Procedimiento

  • Introducir 5 mL de leche en un tubo de ensayo.

  • Añadir 5 mL de la solución de 1,4 fenilendiamina.

  • Añadir dos gotas de la solución de peróxido de hidrógeno.

  • Observar la coloración dentro de los 30 segundos siguientes.

Interpretación

  • Si aparece color azul en los 30 segundos siguientes a la mezcla de los reactivos, la reacción es positiva existiendo actividad peroxidasa en la leche ensayada.

  • Si no aparece color la reacción es negativa, lo que nos indicaría que la peroxidasa ha sido inactivada por el calentamiento.

  • Si el color azul aparece más de 30 segundos después de la adición de los reactivos a la leche, la reacción no es específica.

 

DETERMINACIÓN DE ADULTERACIONES Y FRAUDES EN LA LECHE

Este tercer módulo de prácticas de laboratorio está destinado a completar la inspección y control de la calidad de la leche a través de la determinación de adulteraciones y fraudes, analizando las sustancias añadidas de forma fraudulenta a la leche que afectan a la calidad sanitaria y a la calidad general del producto. Hoy en día los controles de calidad en origen y los programas de mejora de calidad higiénica de la leche han disminuido la incidencia de adulteraciones y fraudes en la leche cruda. Una de las fraudes de mayor interés a la hora d investigar sería la detección de antibióticos en leche.

 

OBJETIVOS

  • Conocer la metodología de laboratorio que se pueden aplicar para determinar el la investigación de residuos de antibióticos en leche.

  • Interpretar los resultados de acuerdo a la legislación y emitir un dictamen sanitario.

 

DETECCIÓN SEMICUANTITATIVA DE LOS ANTIBIÓTICOS EN LECHE

Fundamento

Para el tratamiento de las mamitis y otros procesos infecciosos se administran a los animales un amplio rango de medicamentos con efecto bactericida, como la penicilina G, ampicilina, tetraciclinas y sulfamidas. Estas sustancias antimicrobianas pueden llegar a la leche por los tratamientos que se aplican vía intramamaria, a través de alimentos medicamentosos y por el uso inadecuado de medicamentos administrados intramuscularmente. La presencia de residuos de sustancias antibacterianas en la leche plantea problemas sanitarios por dos razones:

  • Por constituir un riesgo sanitario para el consumidor, pudiendo aparecer los siguientes efectos: reacciones alérgicas en personas sensibles, reacciones de carcinogenicidad si la exposición es prolongada, y desarrollo de microorganismos resistentes a los antibióticos.

  • Por ser un problema tecnológico al interferir en el crecimiento de los cultivos iniciadores utilizados en la preparación de productos lácteos como el queso y las leches fermentadas.

Para la determinación de antibióticos en leche se utiliza el Kit de detección semicuantitativo basado en técnicas microbiológicas. El principio de esta técnica se basa en añadir una muestra de leche a un agar que contiene un indicador de pH y esporas de Bacillus steraothermophilus var. cardiolactis. El medio de cultivo es inicialmente púrpura, y tras el crecimiento de los microorganismos, durante un periodo de incubación y en presencia de la leche, se producen cambios en el medio que van acompañados de la producción de ácido y de una disminución del pH. Como respuesta a este cambio del pH el indicador vira de púrpura a amarillo poniendo en evidencia el crecimiento del microorganismo y la ausencia de sustancias antibacterianas. Si por el contrario el medio se mantiene púrpura tras la incubación, sospecharemos de la presencia de antibióticos que inhibirían el crecimiento de los microorganismos presentes en el agar.

 

Materiales y Reactivos

  • Kit de detección de antibióticos en leche CHR Hansen (500145 Copan Test P&S).

 

Procedimiento

  • Tomar una muestra de leche de un volumen de 100 µl con la pipeta d del kit y adicionar en uno de los tubos preparados para el ensayo. Tener la precaución de utilizar una pipeta nueva para cada muestra.

  • Colocar el tubo en una esufa o baño maría s 64±1C e incubar.

  • Leer los resultados en el cambio de color del medio de cultivo cuando ha transcurrido el tiempo de incubación (3 horas).

  • Las muestras deben ser ensayadas paralelamente con un control positivo constituido por una solución patrón de penicilina con una concentración de 0.004 µg/ml (0.0067 UI/ml), y con otro control negativo que será leche desnatada en polvo sin sustancias antimicrobianas.

 

Interpretación

El kit semicuantitativo permite detectar la presencia de sustancias antibacterianas en leche cuando se encuentran en concentraciones superiores a los Límites Máximos Residuales (LMR). Para interpretar los resultados obtenidos tendremos en cuenta las variaciones de color de la muestra problema, del control negativo y del control positivo, tal y como se muestra en el siguiente Cuadro.

 

Control positivo

(0.004 g de penicilina/ml)

 

Control

negativo

 

 

Color de la muestra

problema

 

Interpretación

 

Púrpura

 

Amarillo

 

Púrpura

Presencia de sustancias antimicrobianas en la leche por encima de los LMR

 

Púrpura

 

Amarillo

 

Amarillo

Ausencia de sustancias antimicrobianas

 

Púrpura

 

Amarillo

 

Coloración púrpura

irregular

Presencia de sustancias antimicrobianas en concentraciones bajas

 

 

Púrpura

 

 

Púrpura

 

 

Púrpura

Ensayo mal realizado por ausencia de esporas viables del Bacillus stearothermophilus var. cardiolactis

 

En el caso de que la muestra de positiva habría que decomisar la partida de leche y no autorizar su destino para consumo humano, procediendo a completar el análisis con un estudio que nos permita cuantificar e identificar las sustancias antimicrobianas presentes en la leche.

 

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