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Práctica 1 - Microorganismos marcadores: recuento total (en placa) de microorganismos en los alimentos

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3.4 MICROORGANISMOS MARCADORES: RECUENTO TOTAL (en placa) DE MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS

 

3.4.1 MICROORGANISMOS VIABLES MESÓFILOS Y PSICRÓFILOS

3.4.1.1 Fundamento

En general los recuentos bacterianos bajos están asociados con alimentos seguros. La mayoría de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. Algunos microbiólogos han estimado el recuento bacteriano como uno de los mejores indicadores del grado de alteración de los alimentos.

 

3.4.1.2 Material

  • El necesario para hacer disoluciones de la muestra (ver protocolo de disoluciones).

  • Placas de Petri y pipetas de 10 mL y 1 mL, estériles.

  • Agar triptosa-glucosa-extracto de levadura (Plate count agar) fundido, en el baño termostático a 45°C, estéril.

 

3.4.1.3 Preparación del medio, incubación y expresión de resultados

  • Hacer disoluciones de la muestra al 1/10. 1/100.etc, según estime el grado de contaminación.

  • Poner 1mL de cada disolución decimal en placas de Petri (por duplicado).

  • Añadir 15 mL de medio de cultivo (fundido, a 45°C en un baño termostático) y dar movimientos circulares y de vaivén para que se distribuya la muestra uniformemente.

  • Incubar: una serie de placas a 20°C/ 3 días (psicrófilos) y otra serie de placas a 35°C/ 2 días (mesófilos). Para incubar las placas introducirlas invesrtidas en la estufa.

  • Pasado el período de incubación contar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

  • Expresar el resultado en ufc/g de alimento. Para ello se cuenta el duplicado y se halla la media, multiplicándose por la inversa del factor de dilución en el que se realizó el recuento.

  • También es adecuado expresar el resultado calculando el logaritmo del valor anterior log ufc/g.

 

 

aerobios mesofilos.jpg

 Colonias típicas de microorganismos mesóficlos en medio PCA

 

3.4.2 RECUENTO TOTAL DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

3.4.2.1 Fundamento

Generalmente la presencia de mohos y levaduras está aumentada en los alimentos cuyo pH es de 4.5 o menos, tales como jugo de tomate, mahonesa, conservas de frutas, bebidas acidificadas, etc., y otros como helados, mantequilla, leche condensada, quesos, azúcar, etc.

3.4.2.2 Material

  • -Placas dePetri.

  • -Pipetas estériles de 1 y 10 mL.

  • -Frasco de 100 mL de agua destilada estéril.

  • -Agar OGYE.

  • -Suplemento antibiótico: oxitetraciclina.

3.4.2.3 Preparación de medios y suplementos

El medio:

  • -Disolver 32.5g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1 L de capacidad.

  • -Llevar a ebullición mediante calentamiento en placa calefactora con agitación.

  • -Trasvasar la mezcla a un bote Pyrex de 1 L de capacidad e introducir en el autoclave a 121ºC durante 20 min.

  • -Atemperar el medio a 50 ºC en un baño termostático.

El suplemento antibiótico

  • -Se prepara añadiendo 10 mL de agua destilada estéril al vial de antibiótico.

  • -Cuando el medio de cultivo se utiliza y se encuentra atemperado a 50°C se disuelve en la proporción de 10 mL del vial en 500 mL de medio o la proporción adecuada.

  • -Repartir el medio en botes de Pyrex de 100 mL de capacidad previamente esterilizados.

 

3.4.2.3 Método de siembra, incubación y expresión de resultados

  • Poner 1 mL de la dilución en la placa de Petri.

  • Añadir 15-20 mL del medio previamente fundido.

  • Homogenizar con movimientos giratorios y en cruz con cuidado de no manchar con el agar la tapa de la placa de Petri. Dejar solidificar.

  • Incubar a 25 ºC (temperatura ambiente) durante 5 días realizando lecturas a los 3 días para observar el crecimiento de las colonias y efectuar un primer contaje. A partir del segundo día seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

  • Expresar el resultado como unidades formadoras de colonias (ufc)/g de alimento.

 

levadura candida.jpg

Crecimiento de colonias del Género Candida en agar OGYE

 

 

3.4.3. INVESTIGACION Y RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS Y VEGETATIVAS DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES

3.4.3.1 Fundamento

Los microroganismso anaerobios obligados (Bacillus, Clostridium...) sólo pueden crecer a bajos potenciales redox, y algunos únicamente crecerán en ausencia de oxígeno. Suelen encontrarse en la parte interna de los alimentos no procesados y juntamente con los anaerobios facultativos constituyen los principales microorganismos de la alteración. Su valoración en los alimentos nos sirve como indicador de contaminación telúrica remota por la presencia de esporas resistentes. El número máximo de esporas, es decir, el "número total de esporos", se puede determinar usando tratamientos térmicos de la muestra del orden de los 70-80°C durante 10-15 minutos, con lo que conseguimos destruir las formas vegetativas y revivificar tan solo los esporos. Al hacer recuento hay que partir del principio de que una espora da lugar a una colonia en el medo de cultivo.

 

3.4.3.2 Material

  • Pipetas de 1 mL.

  • Placas de Petri estériles.

  • Botes pyrex de 100 mL.

  • Jarar de anaerobiosis.

  • Kit de generación de condiciones de anaerobiosis AnaerogenTM (Oxoid).

 

 jarra-de-anaerobiosis

Jarra y kit para anaerobiosis

 

3.4.3.3 Preparación del medio

  • Agar SPS ( Agar sulfito- polimixina - sulfadiazina).

  • Se disuelven 20 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitación. Pasar a botes de Pyrex de 100 mL.

  • Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

  • El medio resultante es de color claro y amarillento.

 

3.4.3.4 Método

  • Sacar el medio del frigorífico y fundir mediante calentamiento en microondas. Atemperar a 45-50ºC en un baño termostático.

  • Poner 1 mL. de cada dilución en placa de Petri, estéril.

  • Añadir 10-15 mL. de agar SPS, y dar movimientos circulares y de vaivén para que el inóculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar. También se puede cultivar en agar en tubo.

  • Incubar a 46ºC durante 24-28 horas en anaerobiosis utilizando una jarra de anaerobiosi y un kit de generación de condiciones de anaerobiosis.

  • Contar las colonias negras crecidas y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL de alimento.

 

3.4.3.5 Interpretación.

El medio utilizado es selectivo para gérmenes sulfito- reductores. El sulfito sódico, por la acción sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro , da lugar a sulfuro de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La sulfadiazina sódica es selectiva e inhibe el crecimiento de gérmenes Gram negativos.

 

 clostrios.jpg

Crecimiento de colonias de Clostridium en agar SPS

 

3.4.4 INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES

Identificación de colonias típicas en medio sólido

 

3.4.4.1 Preparación del medio

  • VRBG: Agar biliado rojo violeta glucosa.

  • -Se disuelven 19 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitación.

  • -No resulta necesario ni deseable una esterilización.

  • -Trasvasar a botes de pyrex de 100 mL de capacidad previamente esterilizados.

  • -Conservar en el frigorífico hasta el momento de su utilización.

 

3.4.4.2 Método

  • Sacar el medio del frigorífico y fundir mediante calentamiento en microondas. Atemperar a 45-50ºC en un baño termostático.

  • Poner 1 mL. de cada dilución en placa de Petri, estéril.

  • Añadir 10-15 mL. de agar VRBG, y dar movimientos circulares y de vaivén para que el inóculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar.

  • Añadir 4-5 mL. del mismo medio sobre la superficie solidificada, para evitar el crecimiento en superficie.

  • Incubar 18-24 horas a 37°C.

  • Contar las colonias típicas y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL. de alimento.

 

3.4.4.3 Interpretación.

Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con producción de ácido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación también violeta, se consideran Enterobacteriaceae.

 enterobacterias.jpg

 

Colonias rojo violeta típicas del crecimiento de Enterobacterias en VRBG

 

3.4.5 INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS LACTOSA POSITIVA (COLIFORMES)

3.4.5.1 Fundamento

Para la detección de Enterobacterias lactosa positivas (coliformes) se aprovechan ciertas características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en presencia de sales biliares.

 

3.4.5.2 Material

  • El necesario para hacer diluciones de la muestra.

  • Pipetas de 1 y 10 mL, estériles.

  • Tubos.

  • Ser-O-Tap.

  • Campanas Durham.

  • Caldo lactosado con bilis y verde brillante (BBGB).

  • Estufa a 37°C Y A 45ºC

 

3.4.5.3 Preparación del medio:

  • BGBL o BGVB: Caldo lactosado biliado verde brillante.

  • Agregar 40 g a 1 litro de agua destilada en un Erlenmeyer de 1,5 L de capacidad.

  • Se preparan tres series (una por cada dilución decimal) de cinco tubos por cada alimento, añadiendo 10 mL del medio en cada tubo. Introducir una campana de Durham en cada tubo. Tapar con Ser-O-tap.

  • Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min. Comprobar que ha desaparecido el gas de todas las campanas de Durham.

 

3.4.5.4 Método e interpretación

  • Seguir la técnica del número más probable (NMP) como se describe a continuación:

  • En cada uno de los tubos de la primera serie se vierte 1 mL de la dilución de la muestra 1/10.

  • En cada uno de los tubos de la segunda serie se vierte 1 mL de la dilución de la muestra 1/100.

  • En cada uno de los tubos de la tercera serie se vierte 1 mL de la dilución de la muestra 1/1000.

  • Incubar las tres series a una temperatura entre 30 y 37ºC haciendo lecturas a las 24 y 48h.

  • La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas en presencia de sales biliares a la temperatura indicada.

  • Con el número de tubos positivos en cada serie, se recurre a la tabla del NMP donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra.

  • Si la misma técnica la realizamos en paralelo e incubamos posteriormente a 45ºC seleccionamos el grupo de “Coliformes fecales”, que contienen una alta proporción de E. coli. Por lo que se pueden utilizar como indicadores de una contaminación fecal del alimento.

 

coliformes.jpg

Caldo Verde Brillante con reacción negativa y positiva (presencia de gas en la campana Durham) al crecimiento de coliformes

 

3.4.6 RECUENTO DE ENTEROCOCOS

3.4.6.1 Fundamento

Los Enterococos pueden tener un papel significativo como indicadores de prácticas de limpieza y desinfección deficientes en las industrias alimentarias, debido a su gran resistencia a la desecación, a las temperaturas elevadas y bajas y a los detergentes y desinfectantes.

 

3.4.6.2 Material

  • El necesario para realizar diluciones decimales.

  • Pipetas de 1 mL.

  • Placas de Petri estériles.

  • Botes pyrex de 100 mL.

 

3.4.6.3 Preparación del medio

  • Agar KAA ( Agar Kanamacina Aesculina Azida)

  • Se disuelven 24 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitación. Pasar a botes de pyrex de 100 mL.

  • Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

 

3.4.6.4 Método

  • Atemperar el medio una vez fundido en un baño a 50ºC.

  • Poner 1 mL de cada dilución en una placa de Petri, estéril.

  • Añadir 15 a 20 mL de medio KAA

  • Realizar movimientos rotatorios y homogenizar.

  • Incubar 24 horas a 37ºC

  • Contar las colonias típicas (pequeñas, de color gris oscuro con halo negro, como consecuencia de la hidrólisis de la esculina) y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL. de alimento.

 

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